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工作原理

当流动相中加入离子对试剂R+或者R-，这些试剂被色谱柱的固定相进行保留，然后溶质进入色谱柱后与离子对试剂进行离子的交换，从而改变化合物的保留。 一般流动相中加入阴离子型试剂时，电离的碱性化合物会保留增加；中性化合物因色谱柱的固定相表面被离子对试剂吸附，造成部分被阻塞，使得中性化合物的保留时间减少；对于酸性化合物因酸性离子和固定相中的离子对试剂相互排斥，加上固定相被部分离子对试剂堵塞，使得酸性化合物的保留时间减少。当流动相中加入阳离子型试剂时，电离的酸性化合物保留增加，中性和（尤其是）碱性化合物的保留会减少。

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(资料图片)

与反向色谱法相比较优势

在流动相中添加离子对试剂可以改善碱性物质色谱峰的拖尾，增加原本保留很弱的酸性或者碱性离子化合物的保留（并且k值合理）。其和反向色谱法中改变流动相pH导致化合物的保留时间变化性质差不多，但是离子对色谱法能够更好的控制酸性或者碱性化合物的保留行为，而且无须使用极端的流动相pH（pH小于2.5或者大于8）。

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什么情况流动相需使用离子对试剂

被分析化合物是离子型样品。

当改变反向色谱法的其他条件被分析的化合物仍无法得到一个很好的保留，或者更换各种条件无法得到一个较好的分离度时。

当且仅当需要时才使用！

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使用离子对试剂的前提

是对需要已知某个峰应一份酸性物质、碱性物质或是中性物质，只有这样我们才可以进行准确去预测出需要添加的离子对试剂对于溶质的保留的影响。

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离子对试剂选择原则

一般对于酸性化合物选择四烷基铵盐R4N+(R+)；对于碱性化合物选择烷基磺酸盐R-SO3-(R-)；有机试剂一般推荐选择使用甲醇，因为这些离子对试剂在甲醇中有更好的溶解度。对于同时有酸有碱的化合物推荐开始使用低pH的流动相加上烷基磺酸盐，因为低pH抑制酸性离子化，离子对试剂增强碱性物质的保留。

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影响离子对色谱法因素

离子对试剂浓度的影响

a.离子对试剂浓度对于化合物的保留的影响，见下图：

假设被分析的化合物的浓度一定，当逐步提高流动相中离子对试剂的浓度时化合物的保留会逐渐增大；当离子对试剂浓度继续增加到色谱柱的固定相被饱和时，化合物的保留达到最大值；继续增加离子对试剂浓度，流动相中会伴随离子对试剂的反离子浓度的增加，反离子会与化合物进行竞争离子的交换保留，导致化合物的保留呈逐渐下降的趋势。

b.离子对试剂浓度的选择

根据文献(1)研究：不同磺酸盐或季铵盐的推荐起始浓度对流动相中的%-甲醇作图如下：

例如，假定使用40%甲醇的流动相，同时加入烷基磺酸盐作为离子对试剂，根据上图75mmol/L的正辛烷磺酸盐、15mmol/L的癸烷磺酸盐都是合适的起始条件。一般选择离子对试剂浓度时建议选择图中非阴影部分浓度，通常离子对试剂的最佳初始浓度为100mmo l/L。此时该浓度会令试剂覆盖色谱柱大约三分之一的固定相表面。

离子对试剂的类型的影响

一般离子对试剂疏水性越强，化合物与之结合后在色谱柱的保留越强。如对于酸性化合物，要达到同一保留时间，选用TBA+（含16个碳原子）时浓度比TEA+（含8个碳原子）浓度低。

流动相pH的影响

当在流动相中添加离子对试剂后，如酸性化合物提高pH值会使得酸性化合物的离子状态增加，此时会增加其与离子对试剂的接触，增加其保留，故提高pH值使得酸性化合物的保留增强，这个与其在不加离子对试剂时调高pH值降低酸性化合物的保留相反。同时对于碱性化合物提高pH值使得分子状态增加，会降低其与离子对试剂的结合，导致化合物的保留减弱。

温度的影响

相对于RPC，离子对色谱法对于温度控制的要求更高，温度的重现性必须较高。否则温度的改变容易引起化合物相对保留比较明显的变化，进而影响化合物的分离。

有机溶剂（B%）强度的影响

改变B%的比例对化合物保留的影响同RPC分离样品时差不多，但IPC还有自己的特点，如增加B%的比例（对于添加磺酸盐作为离子对试剂的流动相），所有的化合物的保留时间会减少，但是对于碱性化合物的保留减少更多。

色谱柱的影响色谱柱因为被离子对试剂部分覆盖，因此色谱柱对化合物保留的实际作用往往被覆盖。通过改变色谱柱控制分离目的不是首选，也不会特别有效。

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其他注意问题

流动相控制pH需更加严格（±0.1个单位或者更高） 添加离子对试剂的检测建议使用210nm以上 添加离子对试剂的流动相平衡较慢。因离子对试剂在色谱柱的吸附和解析附过程非常缓慢，通常新的流动相需要进行几个小时的冲洗才能够达到完全平衡，有条件的可以进行过夜平衡12小时以上，否则在进样过程中化合物保留时间会慢慢的偏移。因此使用离子对试剂时不建议使用梯度洗脱方式。 更换离子对试剂。当需要进行更换离子对试剂时，需要先把原来的离子对试剂进行洗脱下来，再用新的流动相进行平衡。一般烷基磺酸盐可以使用50%-80%的甲醇-水进行洗脱；季铵盐需要使用50%甲醇-缓冲液（pH4-5的100mmol/L的磷酸二氢钾）。要求至少使用等于柱体积的20倍进行冲洗色谱柱，再用新的流动相进行平衡色谱柱。因此对于已用于 IPC 分离的色谱柱不要用于展开不含 IPC 试剂的 RPC 分离；从一种离子对试剂变为另外一种使用同一根色谱柱是可以的。

容易出现伪峰。随行需要进样空白进行比较去除伪峰，当使用不纯的离子对试剂会较容易产生伪峰，此时建议更换使用不同批次或者来源的离子对试剂。

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小结

总的来说当根据RPC方法初步摸索确定必须要使用离子对试剂时，首先根据化合物峰的酸碱性（通过改变pH来判断）确定添加哪种类型的离子对试剂；然后加入一个初始浓度的离子对试剂；最后通过改变流动相B%或者温度、流动相pH及离子对试剂浓度进行调整选择性。

参考文献：

(1)AkosBartha,GyulaVigh,ZitaVarga-Puchony.Basis of the rational selection of the hydrophobicity and concentration of the ion-pairing reagent in reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography[J],Journal of Chromatography A,1990（499）:423-434.

(2)Lloyd R.Snyder, Joseph J.Kirkland, John W.Doln，译：陈晓明，唐雅妍。现代液相色谱技术导论（第三版）。

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撰稿人 |Luffy

责任编辑 | 许飞

审核人 | 何发

标签： 药物检测