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高效液相色谱方法开发通常耗时且费力。大家常采用的方法是，用已经习惯使用的溶剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合，作为起始条件，然后对流动相的比例进行一系列的调整，直至获得比较满意的峰形与分离度。但这样的工作方式通常极为耗时，而且也并不能获得最佳分离条件。

更为系统性的方法策略，是利用好的实验设计，并遵循以下流程，进行高效、高质量的反相色谱方法开发。这个方法开发流程包括： 方法筛选：流动相pH、有机溶剂、以及色谱柱，作为对选择性影响最大、因而也是最重要的条件因素，首先被加以筛选。 方法优化：对以上得到的所有结果，评估这三个因素的何种组合，获得了最佳分离效果。在这个组合条件的基础上，进行优化或微调，以获得最终想要的结果。 方法验证：对最终的方法进行验证，检查它是否满足预期的分离效果与分析目的。

PART01启动为了设计一个有效的测试方法摸索试验，尽可能多地搜集关于样品和被分析物化学特性的信息是很重要的。

方法开发所需信息

-- 样品溶解性能被分析物数量？需要分离多少分析对象色谱峰？ -- 化学结构功能基团？被分析物有何区别？有无可电离基团？电离常数？pH值如何影响色谱分析？ -- 检测需要或可能采用何种检测？被分析物是否有紫外吸收？λmax？ -- 浓度范围和定量要求需要多高检测水平？需要多大定量限？ -- 样品基质影响是否有阻碍分离或检测的基质影响？ >>>>

方法使用的目的

在开发一种测试方法之前，还需要考虑： 是否理解和明确了测试方法的目标和使用目的？ 清楚理解使用目的将有助于确定必须要满足的性能参数以及验证方法所需关键参数？ 例如可能需要从样品的所有组分中分离一种对象被测物的方法，或者可能需要既能从其它组分中分离对象被测物、也能使所有组分之间能够相互分离的方法。 其它考虑因素可能还包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。 我们采用帕罗西汀有关物质分析方法开发实例来展示系统策略。

PART02方法筛选

01pH的影响

当分析物含有可电离官能团时（可电离官能团指，在不同的pH条件下可处于不同程度的电离状态，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH条件将强烈影响分析物的反相保留效果，pH条件的改变也会造成最强烈的选择性改变效果。 酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。pH是如何影响反相保留性质的？对于可电离化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物的极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强。 因此，酸性化合物应使用低pH条件，而碱性化合物更适用高pH条件。中性化合物没有任何可电离官能团，因此，不会受到pH条件影响。 这些点线图，就好比滴定曲线，与分析物分子pKa值高度相关。 在开发方法时，应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件，否则，pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。保留曲线的“平台区”是分析方法耐用性较强的区域。对于帕罗西汀和它的有关物质B、D、G、F，因其胺基结构在不同pH条件下电离状态不同，使用pH 10条件比pH 3条件能够获得更强的保留和更好的分离选择性。由于具有更高分辨率和更好的选择性，pH 10是适合被测物的pH值。 下一步是评估在相同pH 10值下三种不同色谱柱的色谱图，以选择具有最佳分辨率的色谱柱。三种色谱柱都显示了可检测所有组分的能力，由于C18的通用性，因此选择BEH C18色谱柱来对比不同有机改性剂的选择性。

02色谱柱的影响

在选择色谱柱进行分析方法开发时，应充分认识，色谱填料基质(硅胶颗粒、杂化颗粒、聚合物颗粒)因其化学性质不同而会提供不同的保留与选择效果。

不同的键合相，不同的选择性

疏水性－长的烷基链，提供更强的保留 硅羟基活性－影响色谱峰的对称性和次级相互作用 抗水解稳定性－键合相(如C18)通过更多的键键合到基质颗粒上 官能团的密度－影响载样量

03有机溶剂的影响

甲醇和乙腈，是用于反相分离的典型有机溶剂。除了洗脱强度、粘度(与柱背压有关)、紫外吸收性不同，甲醇与乙腈在化学选择性上也有所不同，甲醇可以发生氢键作用，因此会提供显著不同的选择性。 甲醇：洗脱能力较弱、质子化溶剂，提供氢键作用 乙腈：非质子化溶剂、洗脱能力较强、粘度较低(柱背压更低) 有机溶剂相对洗脱强度曲线：实验图谱表明，与乙腈相比，甲醇的洗脱能力较弱，因此所有分析物都获得了更强的保留。但是，对于这个应用，乙腈提供了更好的分离选择性。因此，pH 10、色谱柱BEH C18和乙腈的条件组合，就可以用作下一步的优化微调。

PART03方法优化

有几个参数可以用来调整或优化色谱分离效果。梯度斜率是一个用来操作以控制保留和选择性的物理参数。但是，梯度斜率经常在分离度和灵敏度之间做平衡考量。另外一个可以优化的参数是温度。每个化学过程都受温度影响，温度可以提供明显的不同选择性。当有关物质浓度降低时，有关物质B和D与主峰帕罗西汀的分离度明显减少。这是由于组分与帕罗西汀峰的不同浓度水平造成。这时需要进一步的优化。

方法优化与梯度斜率

更缓的梯度斜率可以提高分离度 降低梯度斜率将降低灵敏度 更陡的梯度斜率可能压缩色谱峰，经常会导致分离度的降低 增加梯度斜率将增加灵敏度 改变梯度斜率时要平衡峰高与分离度的关系 改变保留与选择性

方法优化与温度

减少流动相粘度 降低背压 如果流速保持常数，提高分析物的扩散 更高的优化线速度 改变保留与选择性 温度会影响中间的每一个化学过程，例如增加温度会降低移动相的粘度，如果流动速度恒定将导致系统背压降低，高温将改变固定相和流动相之间的分配速率，然而由于提高了被测物分散性，会加快优化线性速度。 对温度变化敏感的化合物，温度的微小变化都会导致选择性发生独特变化。 此例子中，温度以15 ℃的步幅从30 ℃开始上升到40 ℃和60 ℃，随着色谱柱温度增加，组分的分离性能改善，另外被测物的分散性提高，谱峰更尖锐，色谱柱温度为60 ℃时分离效果最佳。

PART04分析方法验证

分析方法验证经常是由多个步骤组成的反复人工过程，需要进行大量的色谱测试，以充分评估所有八种特性，审视、计算和管理这些过程获得的所有数据可能具有一定的难度。Empower方法验证管理器采用自动化的验证过程，使数据审视更加顺畅，极大提高了验证过程的效率和可靠性。

方法验证提示

方法验证用于确认分析方法的特性能否满足应用要求，验证过程中需要评估的典型色谱法特性是专属性、线性、范围、检测限、定量限、准确度、精度、稳定性。

PART05结论

通过使用包括摸索试验和验证的方法可明显提高色谱测试方法的开发效率。 设计试验研究包括影响选择性的多个参数，例如固定相、pH值、有机改性剂，自动化运行极大加速了测试方法开发流程。 合理审视数据后，完成最终测试方法经常是微调和优化如梯度坡度和温度等变量的过程。 为了保证所开发的方法能够满足应用要求，需要使用前面确定的性能参数对方法进行验证。验证结果－使用Empower方法验证管理器对帕罗西汀方法的验证结果如下：

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