《中国药典》2015年版，在《药品质量标准分析方法验证指导原则》中新增了对校正因子的验证，同时对验证结果做了严格的规定。现就加校正因子的自身对照法验证方式和可接受范围结合自身工作经历提出一些看法，供大家参考。

1 专属性

专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。有关物质方法的专属性实验一般包括空白干扰实验、系统适用性实验和降解实验三部分。

(资料图)

1.1空白干扰实验国家食品药品监督管理局药品审评中心《药品技术评价文集（第二辑）》要求空白无干扰，即空白溶剂或空白辅料不干扰本品有关物质的测定。

1.2系统适用性实验系统适用性实验通常采取分离度实验的方式进行评估，即根据已知杂质的限度配置限度浓度的加杂供试品溶液，考察已知杂质与供试品、各已知杂质及已知杂质与未知杂质间的分离度。要求各已知杂质与供试品及已知杂质间达到基线分离，已知杂质与未知杂质间的分离度大于1.0。

1.3降解实验将供试品在较为剧烈即在酸、碱、氧化、高温（干热和湿热）、光照等条件下进行适当的降解进而考察方法的可行性。

1.3.1降解程度RagineMaheswaran推荐的降解强度为5%～20%；《化学药物分析方法验证的内容和评价》中的推荐值为20%～30%；《国家药品标准工作手册》的推荐值为5%～10%。强制降解实验是模拟药品在生产、储存和使用过程中的极端条件，现实中是极难发生的，同时如果过度降解极有可能造成二次降解致使物料不平衡故建议以低强度长时间（最长时间不建议超过七天，以三天内为宜）的方式进行降解实验以最大可能地模仿现实条件，降解程度以5%～10%为佳，但是对于降解条件已较为剧烈却仍未降解的建议不再加剧降解条件，如各条件均未产生降解产物的建议对相对较不稳定的条件加以复合条件进行进一步考察，以期望能有一条件出现降解产物以验证方法的专属性，如复合条件亦无降解产物产生则不再强求。

1.3.2分离度参照系统适用性实验要求，主峰与相邻杂质峰达到基线分离，已知杂质与未知杂质及各未知杂质间分离度大于1.0。

1.3.3峰纯度 峰纯度主要是考察被分析峰中是否包含其他物质，现有仪器参数具有一定的局限性，无法完全真实地反应实际情况，参考现有仪器的表示方法建议规定主峰纯度因子不小于990，或者纯度阈值大于纯度角。

1.3.3质量守恒《国家药品标准工作手册（第四版）》与《药品技术评价文集（第三辑）》中均要求在±10%以内，本人认为范围过宽，如果排除人为误差，单单考虑仪器的误差将其定在±2%以内是比较合理的，但是考虑到降解程度为5%～10%，同时考虑到人为误差、仪器误差及校正因子因素，建议带入校正因子后将其定为±5%是更合理的。

2准确度

准确度系指采用该测定方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。验证时一般要求根据有关物质的定量限与该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（如LOQ、50%、100%、150%）的同时配制自身对照溶液，按外标法和加校正因子的自身对照法分别测定其含量，将外标法测得值换算成百分含量与加校正因子的自身对照法的测量值进行比较以考察校正因子的准确度，将外标法的实测值与理论值比较，计算回收率，并计算回收率的相对标准偏差以考察方法的准确度。

参照ICH Q3A的相关要求，并结合质量研究的实际情况，对校正因子的准确度拟定如下可接受范围（X表示测得的杂质含量）：

①当X＜0.05%，两测量值不做比较；

②当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

③当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

④当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定各浓度下的平均回收率应在80%～120%，LOQ浓度下的平均回收率应在70%～130%，RSD不大于10%，此范围过于宽泛，而2015年版《中国药典》要求过于苛刻，极难达到，结合实际工作，对方法的准确度实验拟定如下可接受范围：

①LOQ浓度水平，每个样品的回收率均在85%～110%；

②LOQ以上浓度水平，每个样品的回收率均在92%～105%；

③含LOQ浓度各样品回收率的RSD应不大于10%，LOQ浓度水平以上的各样品回收率的RSD应不大于5%。

3 精密度

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度。

一般我们采用加限度杂质浓度的供试品溶液，平行配制6份，按外标法和加校正因子的自身对照法分别测定已知杂质的含量。

校正因子的重复性和中间精密度拟定可接受标准为（X表示测得的杂质含量）：

①当X＜0.05%，两测量值不做比较；

②当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

③当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

④当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定重复性RSD不大于15%，重复性和中间精密度12份数据RSD不大于20%，范围过于宽泛。参照2015年版《中国药典》通则9101的精密度和ICH Q3A的相关要求，并结合实际工作，拟定可接受标准为：

①当X＜0.05%，不计算RSD；

②当0.05%≤X＜0.10%，RSD不得过4，不同实验人员测得值得RSD不得过8或差值不得过0.05%；

③当0.10%≤X＜0.50%，RSD不得过3，不同实验人员测得值得RSD不得过6或差值不得过0.10%；

④当X≥0.50%，RSD不得过2，不同实验人员测得值得RSD不得过4或差值不得过0.20%。

4 线性

系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5份不同浓度的对照品溶液。线性浓度溶液建议从定量限至限度浓度的200%。每份样品溶液进样一针， 以测得的响应信号对被测物的浓度作图进行线性回归，列出线性方程、线性图、相关系数、响应因子、y轴峰面积的截距及剩余标准偏差。

《药品技术评价文集（第二辑）》中规定相关系数不小于0.990，y轴截距应在100%峰面积的25%以内，响应因子的RSD不大于10%；《2010年版-实验室控制系统GMP实施指南》中规定相关系数原料不小于0.998、制剂不小于0.990，y轴截距应在100%峰面积的25%以内，当限度小于0.5%时剩余标准偏差不大于10%。结合现有研发实际经验，拟定如下标准：

①相关系数不小于0.999

②y轴截距不大于100%浓度峰面积的10%

③响应因子的RSD不大于5%

④剩余标准偏差不大于10%

根据线性方程的斜率（k）比计算校正因子。即校正因子=k_主成分/k_杂质。其可接受标准为：

①校正因子在0.9～1.1之间修约为1.0，当其小于0.9时保留小数点后两位，当其大于1.1时保留小数点后一位,另有规定的除外；

②当校正因子为法定标准收载的，偏差在10%以内取法定标准数值，若偏差大于10%应考察其原因，经分析为非方法和人为误差引入的，则按实际测定值作为校正因子；

③当校正因子在0.2～5.0之外时需要考察方法是否需要可行或更换为杂质外标法。

5 定量限与检测限

定量限（LOQ）是指试样中被测物能被定量测定的最低值；检测限（LOD）是指试样中被测物能被检测出的最低量。方法分为直观法、信噪比法和基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法。

我们最常使用的是信噪比法，本人更推荐直观法，因为其更简单直接，只要灵敏度足够好，直观法更有利于操作的简便性和验证项目的通过（如定量限回收率的测定）。现就常用的信噪比法拟定如下标准：

①LOD和LOQ的信噪比分别拟定为2～4和8～12，在保证灵敏度的情况下可以将其适当放宽至2～6和8～15；

②LOQ浓度样品连续进样6次峰面积的RSD不得过10%

③LOQ一般为限度浓度的十分之一，最差为限度浓度的二分之一同时满足低于报告限浓度，考虑到常规药品的最大日剂量是小于2g的现状，LOQ应小于供试品溶液浓度的0.05%。

6 耐用性

系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的成熟程度。

6.1溶液稳定性

一般我们需要对供试品溶液、对照品溶液及对照溶液进行稳定性考察，考察时间取决于实际样品检测最长时间、方法学验证项目中耗时最长项目时间（一般为耐用性）及溶液是否出现不稳定性。对于溶液稳定性小于4h的样品应临用新制并立即进样，低于2h的应考虑更换溶剂、改变放置条件（如进样盘控温）或更改检测方法。

对于对照品及对照溶液建议采用主成分峰面积RSD不大于2%进行判断。对于供试品溶液由于其杂质含量差异较大，如按照峰面积RSD不大于2%进行判断显然是不合理的，对其建议采用面积归一化法进行判断，并符合以下标准即认为供试品溶液是稳定的（X为面积归一化法计算杂质的含量）：

①当X＜0.05%，两测量值不做比较；

②当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

③当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

④当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

6.2 耐用性试验

一般选择对3～5个相关的测定条件进行微小的变动，一般对下列条件进行微小的改变，流动相比例（±5%，如为两项预混流动相，则起始比例的改变不得超过低比例流动相的10%）、pH值（±0.2）、波长（±2nm）、不同品牌或同一品牌不同批次的同类型色谱柱、缓冲盐浓度（±5nmol）、柱温（±5℃）、流速（±0.1ml/min）等。按照常规实验要求取空白干扰溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液等进样，考察色谱条件微小改变后空白干扰现象、系统适用性（以分离度为主，拖尾因子、理论板数等为辅）及各杂质的含量的变化情况。

校正因子的耐用性结果良好结果要求参照精密度项下要求即以外标法和加校正因子自身对照法计算杂质含量（X）应符合以下要求

①当X＜0.05%，两测量值不做比较；

②当0.05%≤X＜0.10%，两测量值的差值在0.05%内；

③当0.10%≤X＜0.50%，两测量值的差值在0.10%内；

④当X≥0.50%，两测量值的差值在0.20%内。

耐用性实验结果良好，需满足一下标准：

①空白溶剂或辅料不干扰本品有关物质的测定；

②系统适用性溶液中各已知杂质与供试品及已知杂质间达到基线分离，已知杂质与未知杂质间的分离的大于1.0；

③按加校正因子的自身对照法计算所得杂质的含量（X）满足校正因子的耐用性实验结果良好的要求。

7 范围

系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。即范围由精密度、准确度和线性的结果所决定。2015年版《中国药典》规定是限度的±20%；ICH Q2规定是报告限到限度的120%或者是LOD或LOQ到限度；USP40的规定是限度的50%至120%。而范围一般是由线性研究所得，考虑到常规原料与制剂的限度区别同时为了减少工作量，故建议线性范围为LOQ至原料限度的300%。

由于《中国药典》对有关物质提出了新的验证要求，特别是提出了校正因子的验证要求，但是并没有相关的法规或指导原则对其进行细化或说明，现根据实际工作经验对其进行了简单的讨论，希望对大家的工作有所帮助，如有不当之处欢迎批评指正。

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