目前，生产供应链遍布全球，因此在很多方面都很脆弱。切换到定制生产还允许引入非常有意义的统计过程控制并减少初始投资。对环境的影响通常也较低；它触发了对训练有素的员工的需求，释放的资源可以投资于新产品。据报道，从批次到连续工艺的这种过渡，可使生产率提高了100倍。 目前最先进的单克隆抗体生产是基于批次平台的工艺。工艺分为上游和下游工艺。重组靶蛋白的生产基于上游工艺过程中生物反应器中的细胞培养。后续下游工艺的目的是通过使用离心、过滤和层析等各种单元操作，从宿主细胞蛋白、宿主细胞 DNA、培养基组分、病毒和内毒素等侧组分中分离出目的蛋白。 平台工艺包括哺乳动物细胞的补料分批悬浮培养，最高可达20,000 L生物反应器体积，离心和深层过滤作为细胞收获，Protein A亲和层析作为捕获，阳离子交换层析作为中间纯化，以及疏水相互作用层析作为精纯步骤。在Protein A亲和层析和低pH保持下进行病毒灭活后，需要进行洗滤，以上样至随后的阳离子交换层析。 从已建立的平台工艺来看，由于上游工艺优化（即细胞工程、培养基和工艺参数优化）实现的产品滴度增加，层析步骤将达到其载量极限。这种限制被广泛称为下游瓶颈。随着产品滴度的增加，上游和下游工艺的单位成本（元/公斤）下降。然而，随着产品滴度的提高，平台下游工艺将达到其最高效率。进一步提高产品滴度会导致商品成本（COG）从上游工艺向下游工艺的显著转移。 连续生物工艺通过提高每个单元操作的生产率和灵活性，同时通过连续产品处理（即较短的保持时间）提高产品质量，从而规避了上述下游瓶颈和批次放大问题。食品和药物管理局、欧洲药物管理局、国际人用药物技术要求协调理事会(ICH)和各种行业工作组已经开始发布指南 (ICH Q8-Q11)，以提高生产过程中的产品质量，从而促进连续的生物工艺。 实现连续生产的全部潜力所需的关键技术和概念是过程分析技术（PAT）和质量源于设计（QbD）指南。与传统的“质量源于检测”或“试错法”相比，可以推导出工艺和产品属性之间基于知识的联系。这不仅可以对过程波动做出动态反应，还可以通过在批准的设计空间内进行过程调整，在输入变量变化的情况下，灵活地保持工艺的最佳状态。从批次到连续生产的过渡中的这些发展最终在数字孪生中达到“高潮”，通过结合基于QbD的工艺开发，强大的PAT在线数据和预测性工艺模型，可实现过程控制的自动化，并在理想情况下实现实时放行检测。 从这个角度来看，PAT可以被理解为一个链接，通过实时交换关键过程数据，使QbD设计和从中衍生的控制策略成为可能（见图1）。图1：在质量源于设计 （QbD） 范式中的生物过程控制的实施。 数字孪生有许多定义，这些定义根据其背景而有所不同。最常见的定义是，数字孪生是物理对象的全面数字表示，能够与该对象进行双向通信。另一方面，在过程自动化团体中，数字孪生被作为生产资产的全面数字表示，响应物理资产的状态并修改其行为。在这方面，Udugama等人提出了一项5步实施战略。从简单的平衡方程到经过验证的过程模型，数字孪生最终是物理过程的数字表示。通过 PAT 实现的测量数据的实时传输和基于模型的高级过程控制，可以实时优化物理过程。这些根据过程模型的复杂性以及可用的数据和控制选项进行排列（见图2）。图2：将稳态数学模型过渡到成熟的数字孪生必须采取的步骤和操作。

过程控制、数据采集、数据评估和建模之间相互作用的详细说明将在别处讨论。

(资料图片)

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单克隆抗体生产以下部分总结了一系列研究，这些研究讨论并强调了通过替代单元操作和开发数字孪生，实现单克隆抗体连续生物工艺的运营成本和工艺开发挑战。

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上游工艺

Kornecki等人开发了一种基于Monod动力学的的宏观动力学模型，其适用于哺乳动物细胞培养的数字孪生目的，开发人员根据一般有效的模型验证工作流进行了验证。该宏观模型基于四个决策标准（合理性、灵敏度、准确性和精确性、以及相等性）进行了确认和验证，并被用于案例研究，包括用于单克隆抗体生产的中国仓鼠卵巢细胞补料分批。结果表明，基于实验设计和Monte Carlo模拟，最高生长速率 μmax 对活细胞浓度 XV 和产物浓度等模型变量的影响最大。此外，偏最小二乘回归统计性评估了较高μmax与较高的细胞和产物浓度以及较高的底物消耗之间的相关性。上游工艺模型的详细信息可以在其它地方找到。下文给出了连续生产场景中“自主”操作的简短摘要和案例研究。 实验模型参数确定误差对过程模型的影响，基于实验误差的传播，必须进行评估，以评估模型精确性。此差异可以包含在Monte Carlo模拟中，以确定模型参数错误对过程模型的影响。在这种情况下，进行了100个模拟，根据实验误差均匀分布每个参数。 Kornecki等人验证的模型可以用作数字孪生的基础。对于连续的抗体生产，随着工艺时间的增加，有许多效应具有不同的值，因此需要进行监测。例如，细胞特异性生产率的降低，除了其它因素外，主要取决于所使用的细胞系。由于细胞特异性生产率随工艺时间推移而导致的浓度波动或连续单克隆抗体（mAb）浓度下降已有报道。模拟研究被用于测试PAT是否能够实现工艺控制策略，以允许补偿后续下游工艺（DSP）中的滴度波动。以下模拟的场景是，使用Helgers等人描述的检测器阵列，在流出液中连续检测mAb浓度和纯度（即高分子量和低分子量浓度）。实时检测数据连续转发到后续的单元操作。该信息被输入到一个过程模型中，该模型计算必要的过程调整，以达到恒定的mAb浓度或恒定的体积流量。所提出的工艺是一种连续的层析工艺。使用数字孪生可实现稳健的过程控制。 灌流模式下，活细胞密度和产物浓度的模拟如图3所示。活细胞和产物浓度在前72小时内增加。然后开始灌流，产物浓度暂时降低，因为被滤出的产物比产生的产物多。不久之后，浓度再次与活细胞密度成比例地增加，直到在大约350小时后达到稳定状态。产品在稳态下的浓度达到1.8 g/L。作为以下单元操作的基础，假设最终稳态浓度为2 g/L。图3：灌流中活细胞和产物浓度的模拟结果。 图4显示了上游工艺（USP）中的浓度波动如何在含产品的相中处理为恒定浓度。聚合物和盐溶液根据同一连接线内的相平衡进行混合。根据杠杆臂规则，产生较少或更多的相；因此，浓度保持不变。在同一条连接线上操作对于确保恒定的产量和产品相位特性是必要的。图4：浓度波动（a）的模拟结果和通过系统调整（b，c）进行浓度补偿。 如模拟研究所示，水性两相萃取（ATPE）可以维持恒定的mAb浓度，即使USP中的滴度波动±50%。这是通过基于相平衡计算必要的聚合物和盐浓度来实现的。拉曼光谱技术是推荐的用于分析USP和ATPE中单克隆抗体浓度的光谱技术，因此是入口和产物相出口流的主要检测器，如图5所示。图5：建议的上游工艺（USP）和水性两相萃取（ATPE）的控制策略。拉曼探针在USP的滤液出口处用作过程分析技术（PAT），并将单克隆抗体（mAb）和侧组分浓度传送到ATPE，ATPE调节聚合物和盐浓度，以产生具有恒定mAb浓度的相，然后将其传送到沉淀单元。

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沉淀

Lohmann等研究了拉曼光谱、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、二极管阵列检测（DAD）和荧光法在线测量单克隆抗体和侧组分的可行性。 数字孪生输入ATPE的输入数据和在线测量的光谱数据。该模型能够控制关键工艺参数，以确保符合关键质量属性。 所有在线测量值都反馈到数字孪生中。图6显示了所描述的高级过程控制（APC）概念的简化说明。蓝色虚线表示沉淀单元和数字孪生之间的信号连接。因此，信号方向由箭头指示。相邻的框显示模型和沉淀单元之间交换的工艺参数。ATPE和沉淀单元之间的在线测量链确定沉淀单元的初始参数（免疫球蛋白G（IgG）浓度、产量和纯度）。此外，测量进料的质量流量。根据质量流量控制器（MFC）信息，该模型计算沉淀剂（PEG 4000）的质量流量，并调整聚乙二醇（PEG）泵的速度。沉淀池中的电导探针用于监测进料和沉淀剂之间的比例。如果出现偏差，则调整PEG泵的速度，以补偿进料的质量流量变化。浊度探针监测沉淀过程并确保沉淀完成，并且没有抗体溶解在上清液中。一旦达到沉淀罐中的定义液位并且沉淀完成（监测浊度），阀门打开，过滤从第一个组件开始（在图7中标记为Subunit 1）。过滤以死端模式进行，以避免产品损失，并将所有沉淀物沉积在膜表面上。压力传感器用于测量跨膜压，以防止压力峰值超出过滤器的工作范围。在临界压力处，阀门切换，分散液被引导到下一个组件。

图6：针对沉淀单元提出的高级过程控制（APC）的简化图示。沉淀罐合并为一个储罐，子单元为过滤模块。

第一个上样的组件进入下一个阶段，即沉淀物的溶解。在这里，来自ATPE的输入变量和最终浓度的规格用于根据模型预测确定溶解中所需的缓冲液体积。通过在膜组件中以高流速切向溢流表面积来溶解。死端过滤压缩了沉淀物，从而导致溶解动力学减慢。实验表明，溶解后需要约14小时的时间才能达到>90%的抗体回收率。溶解回路还包含上述测量设备，其控制溶解缓冲泵的速度以及到产品罐的阀门。一旦抗体的溶解达到静止值，溶解就终止了。该组件进行再生，为下一个过滤阶段做好准备。 所提出的模拟研究是通过为一个子单元提供的数字孪生来完成的。本研究旨在证明沉淀单元可以在生产过程中对过程变化做出反应，并且能够提供恒定的输出浓度。 在最初的模拟研究中，已经模拟了1至3 g/L的进料滴度。溶解后达到3 g/L的最终单克隆抗体浓度。图7（a）显示了不同进料浓度变化时，沉淀步骤中浓度随工艺时间的降低。添加PEG后几秒钟内发生完全沉淀。为了提供恒定的输出浓度，溶解比被修改（图7（b）），并且可以观察到溶解输出中2.7（±0.05）g/L的mAb浓度。这是通过前面提到的对溶解比的调整来实现的。该模拟研究表明，沉淀能够提供恒定的浓度，这对于后续的层析非常重要。图7：提出了情景1（浓度波动）针对沉淀（a）和溶解（b）的模拟结果。

为了研究单元操作对最终过程偏差的响应能力，模拟了3种理论过程变化，其是所描述工艺的现实变化。模拟研究被标记为情景 1–3：

浓度变化

质量流量波动

纯度变化 情景1中的第一项研究包括了所提出的APC概念，以模拟连续运行过程中的波动。为此，使用周期性浓度变化作为输入信号，其波动范围为2.5至1.5 g/L。溶解后应达到2g/L的最终浓度。图8（a）演示了使用和不使用APC的模拟结果。如果没有APC，溶解后会出现浓度波动（灰线）。当通过APC调节溶解比时，该装置可以提供1.85（±0.03）g/L的恒定mAb浓度。图8（b）显示了必须控制哪些参数以确保浓度的一致性。通过调整溶解比（棕色柱），实现目标组分的轻微浓缩或稀释，以产生恒定的输出浓度。与此相关的是剩余PEG含量（橙色柱）的变化，由于热力学平衡，这可能成为限制性的。如图8（c）所示。灰线表示在PEG含量增加的情况下单克隆抗体的平衡浓度。红线表示不同PEG浓度下IgG在进料中的溶解度。蓝色阴影区域表示热力学给定的操作窗口，可以在其中执行实验室工艺。在此操作窗口之外，PEG在重新溶解过程中会发生限制，从而导致产品损失。PEG含量高于5wt%会限制抗体的分解。在工业环境中，溶解产品液流中剩余的PEG不应超过3 wt%的比例。

图8：情景1（浓度波动）的第二个模拟研究结果。（a）由于集成了先进的工艺控制，因此比较了进料浓度和溶解后调整的免疫球蛋白G（IgG）浓度。（b） 为达到2g/L的恒定输出浓度而必须控制的参数。（c）聚乙二醇（PEG）存在下IgG的平衡浓度。（c）中的蓝色区域标记残余PEG含量的操作窗口。

在下一节中，将介绍有关情景2的模拟研究，这些研究解决了质量流量波动问题。初步模拟表明，体积波动主要影响沉降步骤。发生这种情况是因为上清液通过过滤除去，因此不会传递到随后的溶解中。模拟还表明，PEG含量升高不会导致产量损失；因此，这里只显示了PEG含量不足情况下的模拟结果。指出了与所提出的APC集成和不集成的潜在故障模式。质量流量的变化会影响沉淀池中目前的沉淀条件，其使用电导探针进行监测。如果这种波动发生在超过几秒钟的时间内，则沉降池中PEG和轻相之间的比率相对于其停留时间将存在错误的比例。这种情况如图9（a）所示。在操作过程中，所需的PEG含量为12wt%（橙色柱），这导致IgG（浅蓝色线）的平衡浓度增加。结果，目标组分不再完全沉淀，残余部分保持溶解。这种损失表现为沉淀步骤（蓝色柱）中产量的降低。图9：关于过程中体积偏差的模拟研究。（a）体积偏差的影响及其对工艺产量的影响。（b） 同样的情景，但与提出的先进过程控制相结合。 情景2中的第二个模拟研究也涉及集成APC的连续操作。在这种情况下，一旦沉淀罐中的PEG含量降低，PEG质量流量就会被调整。这导致相对于停留时间（10分钟）的平衡浓度短暂增加。之后，再次达到具有正确平衡浓度的工作点，因此不再发生产品损失。在这项研究中，产量损失的差异约为13%。 浓度和质量流量的变化都可以在沉淀单元中、在几秒钟的短时间内得到补偿。这是通过整合APC来实现的。 在PAT倡议的框架内，已经证明了使用在线测量技术的可行性。拉曼光谱仪可达到最佳效果，能够可靠地检测产品浓度和纯度。此外，DAD和拉曼的组合已经过测试，由于正交测量方法，这是推荐的扩展策略，从而提高工艺的稳健性。最后，在借助数字孪生进行的模拟研究中，在线测量数据已成功用于控制该过程。这可使在潜在的进料流量或浓度波动下，将产量损失降至最低。

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层析

Vetter等人报告了他们在用于层析的APC方面的工作。他们的研究提出了一种可靠的入线PAT概念，用于同时监测层析后的不同产物成分。用于纯化的进样原料由4种主要成分组成：IgG单体、二聚体和4.4 kDa和1 kDa的2种低分子量组分。提出的监测设置包括一个UV-可见二极管阵列检测器和一个荧光检测器。应用该系统，达到的目标组分的R2为0.93，二聚体的R2为0.67，第一侧组分的R2为0.91，第二侧组分的R2为0.93。IgG单体均方根误差为0.027 g/L，二聚体0.0047 g/L，侧组分1为0.016 g/L和侧组分2为 0.014 g/L。所提出的监测概念可以可靠地跟踪低至0.05 g/L的组分浓度。对于没有IgG浓度但存在侧组分的样品，零点波动保持在0.018 g/L的标准偏差范围内，从而可以可靠地检测目标组分。入线浓度监测尚未成熟的主要原因是，当存在侧组分时，目标组分的假阳性测量。将荧光和UV-可见光数据的组合用于测试系统，可消除这个问题。研究模拟了该监测系统的使用，其允许在0.05 g/L下自动切割分数。在该模拟中，实现了>99%的一致收率。通过此设置可以补偿工艺进料体积、进料纯度和进料IgG浓度的工艺干扰。如果发生意外的过程干扰，与定时过程控制相比，收率可提高多达 12.5%。 该模拟研究旨在证明在层析工艺的过程控制中使用在线测量数据的效率。此外，它旨在证明所达到的精确性足以实现可靠的过程控制。虽然过程控制和过程干扰可以通过简单的过程控制来处理，但必须使用模型预测控制器进行过程在线优化。这些是先进过程控制最常用的方法之一，并能够利用优化例程实现自动化过程优化。基于模型预测控制器的APC的主要问题是由于老化、污染或堵塞引起的过程漂移。这种漂移可以在模拟中使用在线数据执行，从而实现过程的实时反馈并允许连续的参数拟合。 使用入线测量和化学计量学的APC是在生物制药纯化中建立稳健连续下游生产的最有希望的方法。入线光谱数据未被广泛用于过程控制的主要原因之一是，如果存在其它组分，则针对目标分子的检测缺乏特异性。当使用不同光谱方法的组合时，可以消除这个问题。DAD和荧光光谱的结合消除了在DAD中观察到的零点波动的高可变性，同时能够测量主要组分和侧组分。 采用数字孪生将允许分馏控制、工艺优化以及对“老化”过程的监测。可以计算主要组分和侧组分的洗脱时间。然后，这可用于控制分馏阀。另一种控制策略是使用入线浓度测量的分馏控制，这项工作对此进行了建模。所述控制系统能够应对进料浓度和体积变化高达50%的过程波动，同时保持恒定的浓度和工艺收率。与定时馏分切割相比，收率可提高12.5%。除集成式逆流层析外，该检测方法还可用于多柱逆流溶剂梯度纯化或常规批次层析。 除光谱数据外，其它传感器数据（如电导、pH 值和渗透压）也显示出对目标组分回归的微小改进，但对这项工作的回归质量没有显著影响。

作为监管机构提议的RTRT（实时放行检测）的一部分，入线浓度和纯度测量将发挥重要作用。据报道，使用FTIR，可以控制其它CQA（关键质量属性），如生物功效或糖基化。此外，通过光谱控制这些参数，过程分析的半自动化正变得越来越可行，因为它是在可接受的时间内、通过酶联免疫吸附分析从入线数据中生成生物效率数据的重要补充。

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案例研究总结在 USP 和随后的直接 ATPE 中，拉曼光谱、傅立叶变换红外光谱、荧光光谱和UV-Vis光谱已成功应用于滴度和纯度预测。拉曼光谱是最通用和最稳健的方法，推荐作为主要的PAT。在沉淀中，滴度检测获得了类似的结果。对于FTIR、荧光和UV-Vis，纯度的预测具有挑战性，但可以通过拉曼光谱实现。在层析中，UV-Vis和荧光光谱的组合能够克服由重叠的侧组分光谱引起的滴度和纯度预测方面的挑战。拉曼光谱在工艺的早期阶段特别有用，而更传统的检测器技术概念，如DAD，可以在工艺的后期阶段使用。光谱数据的组合提高了预测性，如层析所示。 与批次工艺相比，连续操作产生的保持体积要小得多。这导致更短的启动和关闭时间，以及更平滑的系统响应。此外，在连续操作点周围，系统响应更短、更平滑（即几乎恒定）。因此，连续工艺的检测器信号采集时间和相应的采样扫描速率远低于可比的批次操作。由于自然系统差异引起的变化不那么陡峭 - 也就是说，连续接近恒定的系统响应。相比之下，只有典型的梯度洗脱层析操作，在陡峭的色谱图浓度斜率下具有馏分切割点，才能挑战时间分辨率的准确性。这些浓度的变化在几秒钟内发生，而可行的测量点数受到采样率的限制，这导致每个峰的分辨率为10-50个点。这导致浓度曲线的图像对于分馏来说不够准确。只有捕获步骤中流穿操作模式的典型突破曲线不同，并且通过更高的采集时间和平均扫描也有足够的描述性。 基于开发的光谱预测，在基于所有单元操作的、经过验证的数字孪生的复杂模拟研究中，证实了单元操作的动态过程控制。

每个数字孪生都使用预测过程模型作为基础。虽然直观上很明显，这些必须在细节上有所不同，但可以根据一致且明确的验证方案来开发过程模型，该方案考虑到它们在受监管行业中作为数字孪生的使用。在 USP 或 DSP 中使用的数字孪生之间，或者在批次操作和连续操作中，没有根本的区别。然而，虽然在USP工艺中，由于系统在几分钟的低频下变化相对缓慢，因此过程数据通常足以实现控制和优化，但在高度动态的过程和快速变化的浓度中，例如层析中，有必要使用更快的采样速率，最高可达几分之几秒。

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展望和未来趋势从批次生产到连续生产的转变不仅会影响单克隆抗体等已成熟的“重磅炸弹”产品的生产，而且还必须反映在大流行期间短期内提供所需疫苗的必要进一步发展。连续生物药生产中的数字孪生将需要关键技术和概念，如PAT和QbD（图10）。图10：质粒生产、质量测试和mRNA生产工艺概况。该工艺包括3个主要步骤：质粒生产、线性化和体外转录。在线性化和mRNA纯化后，需要进行大量的质量检测。 在mRNA疫苗生产的情况下，在控制线性化DNA时，最先需要大量的质量控制，这是生产实际mRNA药物的起始材料，其次，在纯化的mRNA药物可以被包封之前，检测也是必要的。这导致保持时间可能长达数周。PAT是连续生物生产的必要关键技术。大多数（光谱）传感器基于化学计量计算（例如，偏最小二乘回归、主成分分析），这些已经在文献中广泛使用。此外，还有基于模型的传感器，可以基于质量和/或能量平衡以及（扩展的）Kalman滤波器，其实施更耗时。然而，最后提到的传感器提供了扩展的工艺理解，因为它们可以基于物理化学效应。 在自动化方面，连续生物生产中的数字孪生依赖于在线过程数据，这些数据可以实时更新馈送到过程模型中的信息。除了压力、电导率、pH 值和温度等简单工艺参数外，目标组分和主要杂质的浓度对于确保从数字孪生收集的信息的可靠性也是必要的。拉曼光谱、FTIR、UV-Vis、荧光和圆二色性等光谱技术已被证明是各种生物药生产工艺的合适检测方法。 为了评估APC技术的潜力，Schmidt等人通过拉曼光谱（拉曼位移1800-400 cm−1）、FTIR光谱（1800-800 cm−1的吸收频率）和DAD（波长200-500 nm）探索了不同浓度和纯度范围内碱裂解后的质粒浓度。 必须克服挑战，例如用于病毒和病毒样颗粒等创新疫苗类型以及寡核苷酸（如mRNA和质粒DNA）的光谱和其它在线测量技术的方法，与重组蛋白相比，针对这些产品的方法很少被研究。这些在线测量技术不仅对于确保自动化过程控制并因此弥补合格操作员可能的短缺是必要的，而且还可以在长期内引入对急需药物的实时放行检测，从而缩短耗时的质量控制所导致的延长放行时间（图11-13）。

图11：碱裂解和澄清后的拉曼原始（a）和处理后光谱（b），以及相比对照的滴度预测（c）。

图12：碱裂解和澄清后的傅里叶变换红外原始（a）和处理后光谱（b），以及相比对照的滴度预测（c）。

图13：碱裂解和澄清后的拉

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总结连续生物生产的研究已经证明了其协调高质量产品的潜力。连续生产需要过程自动化，即使灌流的连续操作与石化行业长达数月的操作时间相比，可能相对较短，约为2周至2个月。自主操作可减少产品质量差异，并通过先进的过程控制策略，将操作状态保持在最佳状态附近。好处是降低运营成本，减少生产人员 - 这在当今无论如何都很少见 - 以及通过RTRT实现质量保证成本的显著降低。APC的基础是人工神经网络、严格或混合模型。基于过程模型的数字孪生需要针对监管决策进行独特验证，并通过基于PLS的数据评估与PAT相结合，以实现过程控制策略。 数字孪生使培训模拟器与现有的过程控制系统相结合，是石油、基础和精细化工行业中成熟且有益的程序。此外，操作员的工作量大大减少，因为他们能够并行运行不同的工作 - 这是在增强产品稳健性时最想要的产能增加选项。基于数字孪生的过程自动化可将所需的操作员数量减少 2 倍，并大大降低他们的应力水平。此外，由于连续生产方法和由此保证的稳定状态，产品质量波动较小，由于PAT支持的RTRT，其上市时间更短，批次故障率更低，对于mRNA的生产，生产率可提高约20%。 这证明了整个连续生物生产方法在数字孪生的持续工业化方面的特定竞争力。

原文：A.Schmidt, H.Helgers, L.J.Lohmann, et al., Process analytical technology as key-enabler for digital twins in continuous biomanufacturing. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2021.

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来源 | 网络

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发

标签： 连续生产 数字孪生